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[00887943]类caspase调控铝诱导花生根尖PCD作用机理的研究

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类型: 非专利

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技术详细介绍

铝(Al)毒害严重影响酸性土壤中农作物的产量和质量,对铝毒害的研究已有较多报告,但植物铝毒害和耐性机制仍然不清楚。花生是中国的重要油料作物,而对花生铝毒害和耐性机理的研究还较少。 该实验以花生品种99-1507(耐铝型)和中花2号(敏感型)为材料,检测100μmol/L AlCl3处理0、4、8、12h的花生根尖蛋白提取液中类Caspase-1-,-2-,-3-,-4-,-5-,-6-,-8-和-9,并在添加特异抑制剂的情况下,比较根伸长生长、根尖细胞死亡率、根尖铝离子含量、苏木精染色、DNA ladder、DAPI、类caspase活性等指标的变化,确定caspase-3-like是Al诱导PCD发生关系最密切(活性最高)的类caspase蛋白酶,并且对敏感型品种的影响高于耐铝型。同时利用RACE技术克隆到花生Ahcas-3,其ORF为编码序列1068bp,编码355aa的cDNA序列,通过RT-PCR, west blot等实验,推测Ahcas-3属于诱导增强型基因,其表达诱导或促进PCD的发生,Al诱导的Ahcas-3基因表达与耐铝性负相关,同时促进衰老基因AhSAG表达,且在其上游进行调控作用,促进PCD的发生。加入Xho I和Sal I两个酶切位点及保护碱基,构建Ahcas-3基因的正义、反义植物表达载体,获得转基因植株。比较对照、正义和反义表达的植株中的线粒体的生理变化及亚细胞定位及其与PCD发生的关系,发现铝处理后正义转基因植株根尖积累的铝更多,膜脂过氧化水平更强,活性氧通过引起线粒体膜脂过氧化,改变线粒体膜通透性,激活提高caspase-3-like的活性,诱导PCD的发生。
铝(Al)毒害严重影响酸性土壤中农作物的产量和质量,对铝毒害的研究已有较多报告,但植物铝毒害和耐性机制仍然不清楚。花生是中国的重要油料作物,而对花生铝毒害和耐性机理的研究还较少。 该实验以花生品种99-1507(耐铝型)和中花2号(敏感型)为材料,检测100μmol/L AlCl3处理0、4、8、12h的花生根尖蛋白提取液中类Caspase-1-,-2-,-3-,-4-,-5-,-6-,-8-和-9,并在添加特异抑制剂的情况下,比较根伸长生长、根尖细胞死亡率、根尖铝离子含量、苏木精染色、DNA ladder、DAPI、类caspase活性等指标的变化,确定caspase-3-like是Al诱导PCD发生关系最密切(活性最高)的类caspase蛋白酶,并且对敏感型品种的影响高于耐铝型。同时利用RACE技术克隆到花生Ahcas-3,其ORF为编码序列1068bp,编码355aa的cDNA序列,通过RT-PCR, west blot等实验,推测Ahcas-3属于诱导增强型基因,其表达诱导或促进PCD的发生,Al诱导的Ahcas-3基因表达与耐铝性负相关,同时促进衰老基因AhSAG表达,且在其上游进行调控作用,促进PCD的发生。加入Xho I和Sal I两个酶切位点及保护碱基,构建Ahcas-3基因的正义、反义植物表达载体,获得转基因植株。比较对照、正义和反义表达的植株中的线粒体的生理变化及亚细胞定位及其与PCD发生的关系,发现铝处理后正义转基因植株根尖积累的铝更多,膜脂过氧化水平更强,活性氧通过引起线粒体膜脂过氧化,改变线粒体膜通透性,激活提高caspase-3-like的活性,诱导PCD的发生。

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