[01093209]GAGE基因的重组表达、血清学分析及其致敏树突状细胞抗肝癌活性探讨

①课题来源与背景：原发性肝癌绝大部分为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，是最常见的恶性程度高的肿瘤之一。手术切除和肝移植虽已被认为是肝癌临床治疗的最好手段，但转移和复发仍是影响肝癌术后生存的最大障碍。近年来，随分子生物学及肿瘤免疫学的迅速发展，以肿瘤疫苗为基础的主动免疫治疗已成为治疗肝癌及预防肝癌术后复发和转移的新希望和重点研究方向之一。因树突状细胞(dendritic cells，DCs)是机体内功能最强的专职抗原提呈细胞，并能显著激活初始型T淋巴细胞，处于启动、调控并维持免疫应答的中心环节，故应用DCs为基础的主动特异性免疫疗法治疗肿瘤是近几年最受关注的研究热点之一。DCs与肝癌的发生、发展及免疫逃逸有着密切关系。深入研究DCs与肝癌的相互作用，对于阐明肝癌免疫逃逸机制，探索行之有效的治疗手段具有重要的理论与实际意义。GAGE基因属于癌-睾丸抗原(Cancer-Testis Antigen，CT抗原)之一，于1995年首次被鉴定。CT抗原是最有吸引力、最具有开发前景的抗原家族之一，课题组前期研究发现，GAGE基因mRNA肝癌中有较高频率的表达，提示该基因具有作为肝癌免疫治疗的潜在价值。 ②研究目的与意义：该课题结合广西高发疾病，在前期研究的基础上，深入开展实验，探索以DCs为基础的GAGE瘤苗在肝癌的免疫效应机制，拟在评价GAGE作为肝癌疫苗开发的可行性。 ③主要论点与论据：重要研究结果如下：1)肝癌细胞株QGY-7701中GAGE-1基因mRNA呈阳性表达，提示GAGE-1基因具有作为诊断肝癌的分子标记和免疫治疗肝癌的特异性靶位的潜在价值；2)成功表达纯化了GAGE-1融合蛋白，为进一步深入研究GAGE蛋白奠定了基础；3)血清学检测发现肝癌患者血清中GAGE-1抗体阳性率与其他组之间，统计学有显著性差异。4)免疫组化检测发现，60例HCC组织和相应癌旁肝组织中，HCC GAGE-1蛋白阳性率为43.3％(26/60)；癌旁阳性率5％(3/60)，GAGE-1蛋白阳性率与HCC的病理分级有相关性(P<0.05)，表明GAGE-1蛋白在HCC中表达频率较高，具有较强的免疫原性，有望将其应用于HCC辅助诊断及肿瘤免疫治疗。 ④创见与创新：首次用基因工程方法构建表达GAGE融合蛋白，首次将GAGE融合蛋白致敏肝癌患者DCs，为将GAGE蛋白制成DCs瘤苗提供基础实验依据；首次探讨GAGE融合蛋白孵育的DCs诱导自体CTL体外杀伤肝癌细胞的效应，对进一步将此新发现的抗原应用到肝癌临床诊断、治疗与监测有重要的现实意义。 ⑤应用情况及存在的问题：项目后期横向开展了运用gp96(是免疫治疗中的一种常用佐剂，属于HSP90家族)和smp30(重组衰老标记蛋白30)联合刺激树突状细胞，诱导生成CTL后观察后者对肝癌的杀伤作用。结果转染的树突状细胞比对照组分泌更多的TNF-α和干扰素-β，诱导更多的CTL。表明GP96和SMP30在肝癌中共表达，两种蛋白之间可能存在相互作用。提示它们作为疫苗的组合可以刺激树突状细胞，从而获得更好的抗肝癌作用。存在问题：在项目后期进行GAGE蛋白致敏树突状细胞时，发现存放冰箱的GAGE-1半袋活性下降，故该项目在开展到这一步骤时，临时开展了与该课题关系密切的横向实验。即利用项目组成员刚好有老师在广西医科大学攻读博士的机会，改用SMP-30(也是项目组成员前期从广西肝癌细胞库筛选出来的一种肝癌相关抗原)联合热休克蛋白GP96修饰树突状细胞，利用后者诱导生成CTL，观察其抗肝癌效果。