[01234946]大黄蟅虫丸对肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞干预机制的研究

一、课题来源与背景 目前对肝纤维化逆转的研究主要集中于抑制HSC的活化和加速 ECM 水解两方面,而对逆转 HSEC 结构与功能紊乱、肝内微循环障碍方面的研究则较少。事实上,HSEC 窗孔数量和大小是受神经和体液等多因素调节的,在肝脏受损伤时, HSEC失窗孔化先于肝纤维化发生,是可以逆转的。因此,随着对HSC 结构与功能的研究不断明晰,而针对 HSEC 结构与功能的研究将成为干预肝纤维化的又一个新热点。 HSEC 是构成肝窦的主要细胞,其最具特性的结构是窗孔和基底膜,窗孔在血 液与肝细胞的物质交换过程中发挥筛选屏障作用。肝纤维化时HSEC窗孔数减少 或消失,内皮下基底膜形成,造成了肝窦毛细血管化。HSEC 窗孔是一种动态生 物滤过器,内毒素、酒精等因素能使窗孔变小或消失。研究表明,HSEC 含有微丝和肌动蛋白等,它们参与了窗孔的收缩与膨胀。对肝纤维化大鼠的研究表明, HSEC 失窗孔化先于肝纤维化,并且在去除肝毒素后可以逆转,但在内皮基底膜 形成后则不可逆。HSEC不仅是肝窦的衬里,还具有多种分泌功能,已被看成是 内分泌细胞,肝纤维化后 HSEC 损伤可导致分泌行为和细胞结构的改变。一方面通过窗孔数量及直径的变化调节肝脏微循环;另一方面分泌多种活性物质和其他产物。因此,研究肝窦毛细血管化形成的机理以及与肝纤维化的关系已成为 世界肝病研究领域的一个新热点。 二、研究目的与意义 本项目将明确大黄蟅虫丸是否能成为针对 ET-1、VEGF、CTGF、uPA/ tPA、PAI-1 等因子的拮抗剂或针对 Col Ⅳ、LM、Perlecan 等物质的抑制剂,从 HSEC 的新 视角探讨大黄蟅虫丸对肝纤维化干预作用的分子机制,为中医药治疗肝纤维化提 供新思路,也为开发和利用大黄蟅虫丸治疗肝纤维化提供更多的科学依据。 三、主要论点与论据 3.1 肝窦内皮细胞（SEC）生长曲线的绘制：在传代接种后的第一个 24h,细胞到新的环境必须经历一个适应调试期,也 就是生长潜伏期,细胞数目的变化不显著。24h 后细胞在营养充足,空间足够的 条件下进入对数生长期,细胞数量迅速增加,持续约 3d。到第五天后细胞开始 进入平台期,细胞数量增加速度显著下降,第六天开始细胞数开始减少。 3.2 肝纤维化血清指标检测结果与正常组相比,模型组动物血清中的 HA,LN,PCⅢ,Ⅳ.C 显著升高（P＜0.01）; 与模型组相比大黄蟅 虫丸高、中剂量组血清中的 HA,LN,PCⅢ,Ⅳ.C 显著降 低（P＜0.01）;大黄蟅 虫丸低剂量组血清中的 HA,LN,PCⅢ,Ⅳ.C 显著降低（P＜0.05）; 3.3流式细胞术结果 Annexin-v-FITC/PI 双染色法检测早期凋亡细胞 药血清各浓度组 SEC 细胞对分泌 ET-1、ColⅣ、LM 、Perlecan 蛋白含量比较,差异有显著性,具有统计学意义（p＜0.05）。随着大黄蟅虫丸含药血清浓度的增加, 各组总体的分泌细胞百分比逐渐增加,说明大黄蟅虫丸促 SEC 分泌呈现剂量依赖 性（p＜0.05）。与秋水仙碱含药血清阳性对照组比较,高浓度的大黄 蟅虫丸含药血清组明显增多,差异有统计学意义（p＜0.05）, 3.4大黄蟅 虫丸对 VEGF、CTGF 蛋白表达的影响 Western blot 检测结果显示：空白对照组的 VEGF、CTGF 表达了较高水平, 经给药处理后各组细胞的指标表达均出现不同程度的降低,提示 VEGF、CTGF 的 激/失活调控被打破。大黄蟅虫丸各个剂量组再做组间比较,发现大黄蟅虫丸中、 高剂量组的效应优于大黄蟅虫丸低剂量组和大黄蟅虫丸高剂量组,结果具有统计 学意义（p＜0.05）。从以上所取得的数据来看,大黄蟅虫丸的中、高剂量组对肝窦内皮细胞表现 出明显的抑制作用,提示了大黄蟅虫丸的确存在的抗肝纤维化作用。进一步对其 作用机制进行研究,包括对门静脉细胞的影响、以及对肝细胞 VEGF、CTGF 指标 的检测,实验结果提示大黄蟅虫丸对SEC分泌功能有干预作用,VEGF、CTGF 信 号通路是其抗肝纤维化作用的针对靶点;SEC不仅抑制了VEGF、CTGF 表达,还 能阻断 VEGF、CTGF 与受体结合,从而发挥抗肝纤维化。大黄蟅虫丸作为临床上常用的抗肝纤维化药,也同时具有经济、副作用小的特点,故有望进一步开发成高效抗肝纤维化药物。 四、创见与创新 本次研究结果也能填补 当前SEC抗肝纤维化领域的一些空白。大黄蟅虫丸作为临床上常用的抗肝纤维化药,也同时具有经济、副作用小的特点,故有望进一步开发成高效抗肝纤维化药物。 五、社会经济效益 ,存在问题本项目分析研究 HSEC 超微结构改变和分泌功能紊乱;肝内微血管病变和微 循环障碍的相互关系,探讨大黄蟅虫丸对肝纤维化 HSEC 超微结构和分泌功能的干预作用。但目前针对中成药的临床抗肝纤维化的研究仍较少,也缺乏大样本的临床实 验。下一步如何将动物、细胞实验的成果转化成临床,是我们努力的方向。