[01347748]通过转入抗莪术醇单链抗体基因提高广西莪术中莪术醇含量的研究

本项目以广西道地药材广西莪术（Curcuma kwangsinensis S.G..Lee et C.F.Liang）为研究对象,对其挥发油中具有抗肿瘤活性的化合物莪术醇（Curcumol）,进行单克隆抗体（mAb）制备及单链抗体（scFv）基因构建的研究;在此基础上,从国外引进了慢病毒表达系统,在小鼠骨髓瘤细胞SP2中表达抗莪术醇scFv基因,尝试利用抗莪术醇mAb鉴定莪术醇相互作用蛋白,以期揭示莪术醇抗肿瘤作用的靶点及机理。主要结果如下。 1、从分泌抗莪术醇mAb的杂交瘤细胞中克隆到抗莪术醇mAb轻链和重链基因,以此为模板通过重叠延伸拼接的方法构建了抗莪术醇scFv基因,将抗莪术醇scFv基因克隆在细菌表达载体pET21a中。抗莪术醇scFv基因在细菌中高效表达,但形成了包涵体。进一步将包涵体溶解在8M尿素缓冲液中,利用Ni-NTA树脂纯化抗莪术醇scFv蛋白,然后复性抗莪术醇scFv,结果其复性为可溶性蛋白。 2、引进慢病毒表达系统,在小鼠骨髓瘤细胞SP2中成功地表达了抗莪术醇scFv蛋白,其C端带有Flag标签。慢病毒可以高效感染SP2细胞,感染细胞1周后,在SP2细胞中检测到抗莪术醇scFv蛋白高效表达。尝试鉴定莪术醇相互作用蛋白,建立了初步的实验路线与方法。 3、我们将单链抗体的上第六位的谷氨酸突变谷氨酰胺,提高了单链抗体在原核表达系统的稳定性,同时也增加了真核系统的表达量。 通过抗体基因工程的方法,大规模表达纯化具有重要经济价值及医疗价值的抗体是国际上重要的高科技研究开发方向之一。我们的研究不仅为广西莪术资源开发及品质研究奠定了基础,同时也建立了抗体基因工程上游的基本平台和技术。