[01359505]复方仙草颗粒对阿霉素诱导损伤的人肾小球足细胞CD2AP及nephrin表达的影响

1. 课题来源与背景 由广西科学技术厅2013年度下达的广西自然科学基金课题重点项目《复方仙草颗粒对阿霉素诱导损伤的人肾小球足细胞CD2AP 及nephrin 表达的影响》（合同编号：2013GXNSFDA019016）。 国内外西医研究对于足细胞的分子构成及其损伤的研究已有丰富的成熟的经验并取得了显著的成效[5-16],目前有致力于足细胞体视学的研究的趋向,以从多方面多途径研究探讨保护或治疗足细胞损伤及其作用机制。随着对足细胞损伤机制的深入研究,阐明足细胞病变在肾小球疾病发生发展中的作用,基于对发病机制的认识上更具针对性和个体化、而且能更有效地提高疗效、减少不必要的治疗和药物不良反应的肾小球疾病防治研究具有广阔的前景。 2. 技术原理及性能指标 （1）复方仙草颗粒保护肾足细胞骨架：通过F-actin染色,课题组成员观察到肾足细胞损伤组细胞骨架明显受损,而给予复方仙草颗粒后细胞骨架得以恢复。通过ZO-1染色同样也观察到复方仙草颗粒对肾足细胞的保护作用。 （2）复方仙草颗粒可促进足细胞存活 通过时间依赖实验（time course experiment）和剂量依赖实验（dose dependent experiment）,课题组成员观察到随着给药时间延长、给药剂量增大,肾足细胞存活率越高。进一步通过相差显微镜观察足细胞形态发现,损伤组的足细胞存在明显的凋亡,细胞膜出现明显的鼓泡,并且细胞收缩了。而给予复方仙草颗粒组大部分细胞形态完整,细胞膜表面光滑,仅有个别细胞出现鼓泡皱缩。 （3）复方仙草颗粒抑制足细胞凋亡 通过Hoechst 33342染色,课题组成员观察到损伤组的足细胞形态学发生明显变化,细胞核中的染色体凝聚,而给予复方仙草颗粒组的肾足细胞中凋亡的细胞数目明显减少。为进一步证实复方仙草颗粒对肾足细胞凋亡的抑制作用,我们采用了三种不同的实验方法,分别为Hoechst 33342染色、Annexin V-PI染色流式细胞术计数、TUNEL染色计数的方法。Annexin V-PI染色流式细胞术对凋亡细胞计数表明,复方仙草颗粒能有效抑制足细胞凋亡。TUNEL原位荧光染色的结果同样证明了复方仙草颗粒能抑制肾足细胞凋亡。 （4）复方仙草颗粒抑制肾足细胞caspase途径的凋亡 通过剪切的caspase 3的免疫荧光染色,我们观察到复方仙草颗粒抑制的肾足细胞凋亡是caspase依赖途径。 进一步对caspase信号通路蛋白进行免疫印迹染色,我们观察到前caspase 3和前caspase 9的表达明显增加,而剪切的caspase 3和剪切的caspase 9明显减少,此外Bax, Bid 和剪切的PARP表达减少,Bcl-2, Bcl-xl表达明显升高。因此复方仙草颗粒抑制的肾足细胞凋亡是通过caspase信号通路完成的。 （5）复方仙草颗粒促进肾足细胞自噬 （6）复方仙草颗粒保持肾足细胞完整性 通过Western Blotting和Realtime PCR的方法,我们观察到复方仙草颗粒促进podocin, nephrin, CD2AP的表达,抑制PCX和desmin的表达。 （7）复方仙草颗粒通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路保护肾足细胞 （8）复方仙草颗粒对STAT信号通路的影响 不同剂量的复方仙草颗粒给药后,通过Western Blotting观察STAT6的磷酸化水平我们观察到给予IL13后STAT6磷酸化水平明显升高,而给予中等剂量和高剂量复方仙草颗粒后,STAT6的磷酸化水平明显降低。 综上所述,复方仙草颗粒能有效抑制肾足细胞凋亡,通过调节STAT信号通路和PI3K/Akt/mTOR信号通路对肾足细胞进行保护。 （9）本研究共发表论文8篇,其中SCI收录2篇,培养研究生3名、青年骨干4名,在国内学术会交流5次,在此研究工作的基础上,进一步获得国家自然基金立项资助“壮药复方仙草颗粒对糖尿病肾病GIPRdn转基因小鼠肾足细胞保护作用及其机制研究”（ 81560808）。 3.成果的创造性、先进性。 本项目利用广西道地药材的优势,深入、系统地从足细胞足突形态改变的定量研究探讨中药治疗或保护肾足细胞损伤的作用机制,为抗肾足细胞损伤及其它组织细胞损伤的中医药研究积累可以借鉴的研究思路与方法;从细胞形态学改变的定量研究阐释中医学术理论的科学性,为更好的研究和继承提供新的思路;采用血清药物学方法,将足细胞结构变化与体视学计量参数相结合,运用现代生物科学技术进行定量研究,并比较同一采血时间点和不同采血时间点药物血清的效果等来探讨中药治疗或保护肾足细胞损伤的作用机制,在国内尚属首次。 4.作用意义 本研究探讨复方仙草颗粒通过多环节多途径多靶点保护或治疗肾足细胞损伤的作用机制,为该药的进一步研制开发和临床应用提供科学依据,以利于广西特色中草药八仙草、三七的进一步开发利用。为今后对肾足细胞的研究提供实验依据,并可为抗肾足细胞损伤及其它组织细胞损伤的中医药研究积累可以借鉴的研究思路,为用现代科学理论来阐明中医药的作用机理研究提供一个良好的切入点。 5.应用的范围、条件和前景以及存在的问题和改进意见 本研究运用广西道地药材八仙草、三七等干预阿霉素诱导损伤的人肾足细胞,取得较好的结果。该药在临床上应用将会较大的提高中医药治疗慢性肾病的临床疗效,更好发挥广西丰富中草药资源的优势,促进我区慢性肾病防治水平的提高,从而为我区乃至全国各层次医疗机构提供确有实效、值得推广的简、便、易、效的防治慢性肾病的特色中药制剂,因而具有潜在的社会效益与经济效益,研究成果实用性强,因此具有很好的推广应用价值。下一步将组织申报广西科学技术进步奖。