技术详细介绍
一、项目简介
磷脂酶D（PLD, EC 3.1.4.4）是一类广泛存在于各种生物体的酶，具有水解作用和磷酰基转移作用（见图1）。作为一种酶制剂，PLD的转磷脂酰活性尤为重要，被用于制备具有生物活性的稀有磷脂。其中，以大豆磷脂酰胆碱（PC）为底物，PLD酶法制备磷脂酰丝氨酸（PS），受到广泛关注。PS作为脑健康营养补充剂，相继被美国FDA、日本HBM和中国国家卫生计生委所认证，列为新资源食品。相较于提取自牛脑和植物的PS，生物酶法制备的PS，避免了食品安全和植物源含量低的问题。进一步，一些新的结构和功能磷脂，通过PLD转磷脂酰反应被合成出来，例如，磷脂酰鲨肝醇、磷脂酰葡萄糖、心磷脂类似物、磷脂酰酪醇、磷脂酰萜烯和磷脂酰丝氨醇，它们中一些具有抗癌和抗氧化活性。
二、技术成熟度
直到现在，受限于磷脂酶D来源不足和价格高（链霉菌属PLD，≥150 units/mg， 6516.9 ¥/1000 U，Sigma公司），其工业上的广泛应用受到限制。例如，文献报道的PLD最高产量在104-105 U·L-1，而制备转化得到每公斤PS，需要2.6×106 U的PLD。这一障碍的主要原因是高水平表达的PLD对宿主的严重细胞毒性，导致细胞死亡。
历经5年时间，从上游到下游整体设计，我们解决了毒性蛋白（磷脂酶D，PLD）异源表达难的问题（质粒不稳定、蛋白合成时间短、细胞生长抑制和裂解），PLD生产达到目前世界最高水平106 U·L-1 (748 mg·L-1)（提高20倍）；同时发展一种简单有效提取重组磷脂酶D的方法（无需破碎、无需添加溶菌酶和有机溶剂、室温进行），PLD生产成本有望降低20倍以上。按照实验室规模的一台5 L发酵罐，年产量可以提供3.5×108 U的磷脂酶D，满足100 kg的PS转化需求计算（不计算PLD重复利用率），扩大反应器体积至100-1000 L，PLD产量可满足制备2-20 吨PS的需求。
三、应用范围
经PLD酶法制备的PS、磷脂酰熊果苷等可广泛用于功能食品、药品、化妆品及农牧业等领域。
四、投产条件和预期经济效益
本技术通过微生物发酵生产PLD，菌株表型稳定，原料易得。生产过程不污染环境。对于年产109 U PLD （1kg）的规模，预计设备投资50万元（两台10 L发酵罐），年销售额1000万元。
五、合作方式
技术转让或联合生产，具体合作方式可商议。