[00795086]基于mRNA及miRNA组学技术探讨丹苘软胶囊改善肝细胞脂肪代谢的调控机制

(1)课题来源与背景：非酒精性脂肪肝发病的首要环节是脂质沉积引起的肝细胞脂肪变性，新近研究发现，不少微小核糖核酸(microRNA，miRNA)参与了调控胆固醇、甘油三脂、脂肪酸代谢及脂肪细胞分化。但在肝细胞的脂质代谢中都有哪些miRNA参与？其调控哪些靶基因有哪些？涉及的细胞信号通路如何？则未见系统报道。该研究所观察中药丹苘软胶囊，是针对非酒精性脂肪肝痰瘀互结、湿热内蕴这一主要病机，结合现代药理研究成果，精选丹参、苘麻子二味中药，提取其有效作用部位物质研制而成，并获得国家专利(专利号：201010184447.0)。在前期的研究中证实，该药能通过改善胰岛素及瘦素抵抗，调节SoCS-3、SREBP-1c、ABCA1表达等多种途径改善非酒精性脂肪肝。但上述作用是否通过调控miRNA的差异表达而实现，其多靶点、多通路的调控网络如何？还需进一步研究阐明。该课题项目名称为“基于Mrna及miRNA组学技术探讨丹苘软胶囊改善肝细胞脂肪代谢的调控机制”，来源于2014年国家自然科学基金(地区科学基金项目)，研究时间为2015年1月-2018年12月。 (2)研究目的与意义：该研究项目以非酒精性脂肪变性肝细胞模型为研究对象，用丹苘软胶囊含药血清进行干预，利用全基因组芯片技术筛选差异Mrna及miRNA，运用生物信息学方法对差异miRNA进行靶基因预测，并分别对差异Mrna、预测获得的靶基因进行基因本体学(gO)、KEgg信号通路分析，对二者的分析结果进行比对，筛选出相关的可能信号通路，并通过RT-PCR、Western-blot等技术进行验证。阐明该药物在基因层面改善非酒精性脂肪肝细胞脂肪代谢的调控机制，最后绘制出丹苘软胶囊-miRNA-Mrna-信号通路-细胞功能-疾病治疗的调控网络，为阐释中药"多靶点、多通路"的作用机制研究提供一种高通量、高效率、高准确性的研究方法。 (3)主要论点与论据：A.丹苘软胶囊组差异表达基因的筛选结果示：Mrna芯片共有上调基因512个，下调基因627个。B.丹苘软胶囊组microRNA差异基因的筛选、靶基因预测及Cytoscape的构建microRNA中有9个属上调，14个属下调。选取3个数据库预测的所有靶基因并排除重复基因后共得到5629个预测靶基因，选取所含基因库≥2的靶基因，采用Cytoscape构建调控网络图，在select中设定Degree≥2，并根据Degree的数量制定不同的颜色区分，由多到少依次为rno-miR-26b-5p、rno-miR-129b-5p、rno-miR-21b-5p、rno-miR-193b-5p、rno-miR-201b-5p、rno-miR-184，均下调，显著突出基因为Lrrc57和Jag1。C.丹苘软胶囊组脂肪代谢有关基因的筛选及生物信息学功能分析IPA数据库共检出178个与脂肪代谢有关基因，与该实验差异基因有交集的共31个，这些基因采用DAVID数据库进行gO富集分析，主要参与20种生物学过程(biological pROCess，BP)，包括代谢过程的正负调节、细胞成分组织的调节、细胞代谢过程的正向调节、脂质代谢过程、脂质生物合成过程等；细胞组分(cellular component，CC)分析显示，共含7种组分类型，分别为细胞溶质、质膜区、核质部、超分子纤维、高分子细胞骨架纤维、膜区、核体；显示有20种分子功能(molecular function，MF)，主要是有机环化合物结合、杂环化合物结合、高分子复合物结合、蛋白激酶结合、脂蛋白颗粒受体活性等等。通过KEgg分析发现，有20种信号通路参与，其中神经营养素信号通路、丙型肝炎、子宫内膜癌、PI3K-Akt信号通路差异最显著，P值＜0.01。D.通过western-blot、Qpcr技术对筛选出的可能信号通路进行验证证实了丹苘软胶囊改善肝细胞脂肪代谢的调控机制与3条信号通路有关即：神经营养素信号通路、丙型肝炎、PI3K-Akt信号通路。 (4)创见与创新：该研究所观察中药丹苘软胶囊，是针对非酒精性脂肪肝痰瘀互结、湿热内蕴这一主要病机，结合现代药理研究成果，精选丹参、苘麻子二味中药，提取其有效作用部位物质研制而成，并获得国家专利。该研究从miRNA的差异表达探讨了丹苘软胶囊改善非酒精性脂肪肝的作用机制。绘制出丹苘软胶囊-miRNA-Mrna-信号通路-细胞功能-疾病治疗的调控网络，为阐释中药“多靶点、多通路”的作用机制研究提供一种可借鉴的高通量、高效率、高准确性的研究方法。 (5)社会经济效益：医学上尚无治疗非酒精性脂肪肝病的有效手段，药物治疗尚停留在探索性阶段。近年来，胰岛素增敏剂、调脂药物、抗氧化剂以及护肝药物正越来越受到人们的关注，但是动物实验以及临床研究表明，这些替代性药物治疗非酒精性脂肪肝病的效果差强人意，临床实验发现某些药物甚至可以引发明显而罕见的肝脏毒性，其治疗效果以及安全性均需要在今后的实验中进一步评价。该实验研究结果，从miRNA的差异表达探讨了丹苘软胶囊改善非酒精性脂肪肝的作用机制。为该药的深入研究打下了坚实的基础，也为将来该药开发为临床新药提供了丰富详实的实验依据。 存在问题：该研究尚处在动物实验阶段，如今后能持续深入开展相关研究，顺利取得新药批号，逐步推广运用于临床，将为广大非酒精性脂肪肝患者带福音。预计将产生较大的经济及社会效益。